Nature Genetics 54권, 1390~1405페이지(2022)이 기사 인용
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췌관 선암종은 치료 옵션이 제한적이고 생존율이 낮은 치명적인 질병입니다. 우리는 단일 세포/핵 RNA 시퀀싱, 대량 단백질 유전체학, 공간 전사체학 및 세포 이미징을 사용하여 31명의 환자(치료 경험이 없는 환자 11명, 치료받은 환자 20명)로부터 83개의 공간 샘플을 연구했습니다. 종양 세포의 하위 집단은 증식, KRAS 신호 전달, 세포 스트레스 및 상피에서 중간엽으로의 전이의 특징을 나타냈습니다. 매핑 돌연변이 및 복제 수 이벤트는 선조관에서 관으로의 화생 및 췌장 상피내 신생물을 포함한 정상 및 전이 세포로부터 종양 집단을 구별했습니다. 공간 전사체 데이터의 병리학 지원 디콘볼루션은 뚜렷한 조직학적 특징을 가진 종양 및 과도기 하위 집단을 식별했습니다. 우리는 소진되고 조절되는 T 세포에서 TIGIT의 발현과 종양 세포에서 Nectin의 조화로운 발현을 보여주었습니다. 화학 저항성 샘플에는 메탈로티오네인을 상향 조절하는 염증성 암 관련 섬유아세포가 3배 농축되어 있습니다. 우리의 연구는 이 질환을 앓고 있는 환자의 치료법을 개선하는 데 도움이 될 수 있는 췌관 선암종 종양의 복잡한 하부 구조에 대한 더 깊은 이해를 보여줍니다.
췌관 선암종(PDAC)은 늦은 발견, 조기 전이 및 치료 저항성으로 인해 5년 생존율이 11%입니다2,3,4,5,6. 1차 치료는 수술 후 방사선 및/또는 화학요법을 사용하는 것이며7,8 면역요법 옵션은 제한적입니다9,10. KRAS, TP53, CDKN2A 및 SMAD4(유럽 생물정보학 연구소의 HUGO 유전자 명명법 위원회, https://www.genenames.org/)와 같은 드라이버는 고전적 및 기본 유사 전사 하위 유형을 갖는 것으로 확인되었습니다.
단일 세포 기술은 종양 내용에 관계없이 분석을 가능하게 하고 PDAC에서의 역할이 거의 알려지지 않은 종양 미세환경(TME)의 해부를 용이하게 합니다. 예를 들어, 암 관련 섬유아세포(CAF) 하위 유형이 확인되었으며 세포독성 자연살해(NK) 및 CD8+ T 세포는 종종 수치적으로나 기능적으로 손상됩니다14,15,16,17. 이는 면역이 억제되고 종양을 유발하는 환경을 조성하지만 이것이 어떻게 발생하는지 잘 알려져 있지 않습니다. 포상 세포가 관 마커를 발현하기 시작하는 포상-관 상피화생(ADM)을 둘러싼 인식이 커지고 있습니다. 동물 모델은 KRAS(G12D)가 발현될 때 포상 세포를 PDAC의 기원으로 가정하지만 이 가설은 단일 세포 해상도에서 샘플링된 포상 및 ADM 세포의 부족으로 인해 인간에서 평가하기 어렵습니다24,25 ,26,27,28. 최근의 노력은 만성 췌장염29 및 건강한 인간 췌장30의 선포 이질성에 중점을 두었지만 ADM 세포의 적절한 샘플링은 여전히 부족합니다.
Human Tumor Atlas Network 컨소시엄의 일환으로 우리는 공간적으로 구별되는 다중 샘플링 접근 방식을 사용하여 31명의 환자에 걸쳐 83개의 PDAC 샘플을 분석했습니다31. 샘플은 서로 물리적으로 분리되어 있어 벌크 DNA 및 RNA 시퀀싱(RNA-seq), 벌크 단백질체학 및 인단백질체학, 단일 세포 및 단일 핵 RNA-seq를 포함한 광범위한 오믹스를 통해 종양 간 및 종양 내 이질성을 모두 조사할 수 있습니다. (각각 scRNA-seq 및 snRNA-seq), 세포 이미징 및 공간 전사체학. 우리는 이전에 마우스 모델에서 제안되었던 정상 췌장에서 PDAC까지의 스펙트럼을 따라 과도기 인구와 관련 분자 서명을 식별하고 검증했습니다. 우리는 다중 오믹 접근법을 사용하여 종양 및 간질 집단의 풍부함 및 전사 프로그램에 대한 화학 요법의 차별적 영향을 특성화했습니다. 우리는 다클론/이종 PDAC 종양 특성화를 위한 공간 시퀀싱의 필요성을 강조합니다.
우리는 표준 치료를 받고 있는 21명의 환자로부터 4개의 정상 인접 조직 샘플을 포함하여 73개의 PDAC 샘플을 수집했습니다. 치료 그룹에는 치료 경험이 없는 사례 7건, 신보조 FOLFIRINOX(엽산, 5-플루오로우라실, 이리노테칸 및 옥살리플라틴으로 구성된 치료 요법) 사례 8건, 신보조 젬시타빈 + nab-파클리탁셀 사례 4건, 혼합(FOLFIRINOX 및 젬시타빈 + nab-파클리탁셀) 사례 1건이 포함되었습니다. 한 가지 화학 방사선 요법(Chemo-RT) 사례(보충 표 1). 각 종양은 공간적으로 2~4회 샘플링되었으며, 이후 샘플 세그먼트를 사용하여 조직학적, 영상화 및 오믹스 데이터를 생성했습니다. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 슬라이드; scRNA-seq; 벌크 질량 분석법 기반 단백질체학 및 인단백질체학; 대량 전체 엑솜 서열분석(WES); 및 벌크 RNA-seq (그림 1a, 보충 표 2 및 방법). 우리는 73개 샘플 모두에 대해 scRNA-seq 데이터를 생성했고, 64개 샘플은 WES, 65개 샘플은 벌크 RNA-seq를 생성했습니다. 하위 집합(n = 30)은 직렬 질량 태그(TMT) 11' 단백질체 및 인단백질체 특성 분석을 거쳤습니다(그림 1b). 품질 관리 후, 우리는 발현 프로파일을 기반으로 모든 샘플에 걸쳐 232,764개의 세포를 클러스터링하고 마커 유전자 발현을 기반으로 할당된 세포 유형을 분류했습니다(그림 1c, 확장 데이터 그림 1a-c, 방법 및 보충 참고 사항). 종양 순도의 대용으로 종양 세포의 분율을 사용한 추정치는 샘플 전반에 걸쳐 0.10%에서 82.69% 범위였으며 평균은 16.28%였습니다. H&E 병리학 검토 결과, scRNA-seq의 종양 비율과 일치하는(Pearson R) 샘플 전체에 걸쳐 환자 내 종양 함량 차이가 5~64% 범위(확장 데이터 그림 1d, 방법 및 보충 설명)로 평균 24%인 것으로 나타났습니다. = 0.40, P = 0.001). 벌크 단백질체 및 인단백질체 데이터의 주성분 분석(PCA)은 대부분의 종양 내 영역이 밀접하게 밀집되어 있는 반면 동일한 종양의 여러 표본이 상당한 종양 내 이질성을 가지고 있음을 확인합니다(확장 데이터 그림 1e, f).
1,700 cells) and, consistent with previous studies, we observe PDAC-initiating mutations in KRAS and CDKN2A (from HT168P1) within PanIN populations52. PanIN exhibits increased expression of extracellular matrix-related genes (DCN, SPARC, SPON1), a diversity of collagens57, genes involved in acinar-to-ductal reprogramming (KLF4, MMP7)58,59 and other markers of early-stage malignancy (CXCL12, TIMP3, ITGA1, MUC5AC)60,61,62,63./p>700 cells) (Supplementary Data 3). We found PDAC cells harboring several distinct alterations (Fig. 4a,b). Cells expressing acinar and ductal markers clustered separately from acinar cells and tended to be between acinar cells and normal ductal lineages on the Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) (Duct-like1, Duct-like2), termed ADM_Normal, or between acinar and PanIN, denoted ADM_Tumor (Fig. 4b,c). While tumor and acinar cells express ductal and acinar markers in a mutually exclusive pattern, ADM cells express a combination, suggestive of an intermediate, reversible state (Fig. 4d). While both ADM_Tumor and ADM_Normal have decreased expression of acinar markers, they also have increased expression of PDAC markers and Duct-like1 markers, respectively. Following copy number analysis (CopyKAT, Methods), we found that a majority of predicted aneuploid cells are annotated as PanIN (n = 524), while only a handful (n = 30) in ADM_Tumor are labeled aneuploid (Fig. 4e,f). By mapping both KRAS and CDKN2A mutations, we identified several cells in the ADM_tumor population with either a KRAS mutation (n = 1) or CDKN2A mutation (n = 7), although this was not as widespread as the predicted PanIN populations (KRAS: 23 cells; CDKN2A: 163 cells) (Fig. 4g,h and Supplementary Data 3)./p> 8. All pathogenic or likely pathogenic variants had both their normal and tumor samples reviewed manually by us using the Integrative Genomics Viewer software./p>10,000) and too many unique molecular identifiers (>10,000); possible dead cell or a sign of cellular stress and apoptosis with too high proportion of mitochondrial gene expression over the total transcript counts (>10%). We constructed a Seurat object using the unfiltered feature-barcode matrix for each sample. Each sample was scaled and normalized using Seurat's ‘SCTransform’ function to correct for batch effects (with parameters: vars.to.regress = c(‘nCount_RNA’, ‘percent.mito’), variable.features n = 2,000). Any merged analysis or subsequent subsetting of cells/samples underwent the same scaling and normalization method. Cells were clustered using the original Louvain algorithm99 and top 30 PCA dimensions via ‘FindNeighbors’ and ‘FindClusters’ (with parameters: resolution = 0.5) functions. The resulting merged and normalized matrix was used for the subsequent analysis. Mouse data were aligned to refdata-gex-mm10-2020-A and GFP was added to the reference using the cellranger mkref function (https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/tutorial_mr)./p> PN is actually observed, skipping cases of PT ≤ PN, to avoid over-correcting in the calculation of false discovery rate (FDR). Using this method, we determined that the rate of mutations mapping is significant in the following comparison: tumor cells versus nontumor cells (P ≈ 0), PanIN cells versus nontumor cells (P ≈ 0), tumor cells versus PanIN cells (P = 1.04 × 10−11)./p> CDKN2A > SMAD4 > TP53./p>50× coding region coverage in WES or >50 Mb mapped depth in RNA-seq data./p>
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